本发明公开了具癌细胞抑制活性的化合物及其制备方法与用途，属于生物医药技术领域。本发明从波罗蜜木材中提取了两种具有癌细胞抑制活性的多酚类化合物Artoheterophyllin？J和artoheterophyllin？I，是将木材经95%乙醇超声提取三次，浓缩、大孔树脂分离、洗脱、洗脱液浓缩干燥，再用硅胶和凝胶柱层析分离，收集溶液，浓缩干燥后得样品并进行结构鉴定。本发明提供的两种多酚类化合物具有较强的癌细胞抑制活性，能够制备有效用于乳腺癌，肝癌和肺癌的各种制剂。
1.具有癌细胞抑制活性的化合物，其特征在于，分别具有如式(1)、(2)所示的结构式：ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>
2.权利要求1所述具有癌细胞抑制活性的化合物的制备方法，其特征在于，所述结构式如(1)或(2)的化合物的制备包括以下步骤：(1)波罗蜜木材用95％乙醇超声提取，提取液减压浓缩至干燥物，称重；(2)干燥物用95％乙醇溶解，定性滤纸过滤；(3)上述过滤液与Amberlitexa0XAD16以质量比1:2混合，减压浓缩至干；(4)将上述搅拌物上大孔树脂，先后分别用20％、40％、60％、80％、95％乙醇洗脱；(5)步骤(4)收集80％乙醇洗脱部分6个柱体积，浓缩干燥得样品，称重，用硅胶柱层析分离，二氯甲烷-甲醇洗脱，先后得到1A、1B、1C三个洗脱流分；流分1C进一步凝胶柱层析分离，甲醇-水洗脱，得到1E、1F、1G三个洗脱流分；流分1E进一步硅胶柱层析，二氯甲烷-甲醇洗脱，再用制备型高效液相色谱制备得到artoheterophyllinxa0J或artoheterophyllinxa0I；其中，所述二氯甲烷-甲醇的体积比为50:1，所述甲醇-水的体积比为3:2。
3.权利要求1所述的化合物应用，其特征在于，用于制备具有预防、治疗乳腺癌、肺癌和肝癌作用的功能食品或药物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，采用artoheterophyllinxa0J、artoheterophyllinxa0I中的一种或它们的混合物，通过不加或加入药物制剂辅料制成。技术领域
本发明涉及具癌细胞抑制活性的化合物及其制备方法与用途，属于生物医药技术领域。
背景技术
波罗蜜，又称大树菠萝或木波罗，是桑科波罗蜜属常绿乔木，在海南，广西，广东，云南等地有种植。是我国南亚热带著名的特产水果之一，其果大而美观，味极甜，香气浓郁。现代药理学研究表明，从该植物中获得的一些成分具有抗炎、抗氧化、抑制黑色素生物合成、抑制血小板聚集等诸多药理作用。波罗蜜的木材化学成分有黄酮，萜类，二苯乙烯类，长链脂肪酸类等。前面我们发现一类2′,4′-二羟基取代的黄酮类化合物普遍具有较强的酪氨酸酶抑制活性，作为后续的研究，最近我们又陆续发现一些具有较强癌细胞抑制活性的新化合物和新天然产物。癌症作为一类以细胞异常增殖和转移为特点的疾病，是全球一个主要死亡原因，在2008年造成760万人死亡（约占所有死亡人数的13%）。世界卫生组织预计，全世界癌症死亡人数预计将继续上升，到2030年将超过1310万。特别是肺癌，肝癌和乳腺癌是引起死亡的主要癌症种类。由于缺乏行之有效的化疗药物，寻找有效的抗癌药物仍是今后抗癌新药研发的重要方向。
发明内容
本发明的目的在于提供具癌细胞抑制活性的化合物，尤其是从波罗蜜木材中提取的一类具有癌细胞抑制活性的多酚类化合物，包括artoheterophyllinxa0J和artoheterophyllinxa0I，其结构分别如式（1）、（2）所示：ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>本发明的第二个目的是提供所述具有癌细胞抑制活性化合物的制备方法，通过以下步骤实现：（1）波罗蜜木材用95%（v/v）乙醇超声提取，提取液减压浓缩至干燥物，称重；（2）干燥物用95%（v/v）乙醇溶解，定性滤纸过滤；（3）上述过滤液与Amberlitexa0XAD16以质量比1:2混合，减压浓缩至干；（4）将上述搅拌物上大孔树脂，先后分别用20%、40%、60%、80%、95%（v/v）乙醇洗脱。所述artoheterophyllinxa0J和artoheterophyllinxa0I通过以下步骤得到：步骤（4）收集80%乙醇洗脱部分6个柱体积，浓缩干燥得样品，称重，用硅胶柱层析分离，二氯甲烷-甲醇（体积比50:1）洗脱，先后得到1A、1B、1C三个洗脱流分。流分1C进一步凝胶（Sephadexxa0LH-20）柱层析分离，甲醇-水（体积比3:2）洗脱，得到1E、1F、1G另外三个洗脱流分；流分1E进一步硅胶柱层析，二氯甲烷-甲醇（体积比50:1）洗脱，再用制备型高效液相色谱制备，分别获得artoheterophyllinxa0J和artoheterophyllinxa0I。本发明的另外一个目的是提供多酚类化合物作为抑制剂在制备预防和治疗肺癌、肝癌和乳腺癌中的应用。本发明的两种波罗蜜木材中的提取的具有较强癌细胞抑制活性的多酚类化合物可以作为活性成分，不加或加入药剂上接受的辅料，按照相应剂型的制备方法制成制剂。所述的剂型包括固体粉末、水溶液、醇溶液、乳液、面膜、巴布剂、注射液、滴注液、粉针剂、颗粒剂、片剂、冲剂、散剂、口服液、糖衣剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口含剂、颗粒剂、丸剂、膏剂、丹剂、喷雾剂、滴丸剂、崩解剂、口崩剂、微丸等。本发明的有益之处在于：首次从波罗蜜木材中分离提取得到新的具有较强癌细胞抑制活性的多酚类化合物。制成相应制剂易于质量控制，可在乳腺癌，肺癌和肝癌的相关靶点的疾病和肿瘤药物中应用。
附图说明
图1为新化合物artoheterophyllinxa0J的¹Hxa0NMR谱。图2为新化合物artoheterophyllinxa0J的¹³Cxa0NMR谱。图3为新化合物artoheterophyllinxa0I的¹Hxa0NMR谱。图4为新化合物artoheterophyllinxa0I的¹³Cxa0NMR谱。
具体实施方式
下面将结合实施例进一步详细说明本发明的实质内容和有益效果，这些实施例仅用于说明本发明而非对本发明的限制。此外，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1Artoheterophyllinxa0J和artoheterophyllinxa0I的制备将20kg波罗蜜木材用6倍质量的95%乙醇（v/v）超声波（50Hz，250w）提取2次，每次1h，减压浓缩至干燥，称重。取适量干燥物用95%乙醇（只要能溶解就行，无需精确比例）溶解，定性滤纸过滤，滤液与Amberlitexa0XAD16以质量比1:2混合，自然晾干或减压蒸干，然后上Amberlitexa0XAD16层析柱，先后分别用20%、40%、60%、80%及95%（v/v）乙醇分别洗脱6个柱体积，收集洗脱液。所收集80%乙醇洗脱部分6个柱体积，浓缩干燥得样品，称重，用硅胶柱（200-300目）层析分离，二氯甲烷-甲醇（体积比50:1）洗脱，先后得到1A、1B、1C三个洗脱流分。流分1C进一步凝胶（Sephadexxa0LH-20）柱层析，甲醇-水（体积比3:2）洗脱，得到1E、1F、1G另外三个洗脱流分；流分1E进一步硅胶柱（200-300目）层析，二氯甲烷-甲醇（体积比50:1）洗脱，再用制备型高效液相色谱（Waters制备型高效液相色谱仪，双波长检测器，制备柱为YMC250mm*20mm、粒度为5u）制备，检测波长为280nm，77%甲醇洗脱，即得两个新化合物artoheterophyllinxa0J（保留时间Rt=14.2min）和artoheterophyllinxa0I（保留时间Rt=18.0min）。Artoheterophyllinxa0J的核磁共振光谱数据如下：¹Hxa0NMR(Acetone,400MHz)δ:13.89(1H,s,OH-5),9.21(2H,brxa0s,OH-2′,4′),7.16(1H,d,J=8.4Hz,H-6′),6.67(1H,dd,J=16.4,7.2Hz,H-2″),6.55(1H,d,J=16.4Hz,H-1″),6.52(1H,s,H-8),6.46(1H,d,J=2.4Hz,H-3′),6.44(1H,dd,J=8.4,2.4Hz,H-5′),3.92(3H,s,OCH₃),2.45(2H,m,H-1″′),2.40(1H,m,H-3″),2.45(2H,m,H-1″),2.09,1.05(6H,s,H-4″′,5″′),1.61(2H,m,H-2″′),1.07,1.05(6H,d,J=7.2Hz,H-4″,5″);¹³Cxa0NMR(Acetone,100MHz)δ:184.2(C=O,C-4),164.5(C,C-7),163.1(C,C-2),162.1(C,C-2′),160.5(C,C-5),158.1(C,C-9),157.8(C,C-4′),142.8(CH,C-2″),132.7(CH,C-6′),123.7(C,C-3),117.6(CH,C-1″),113.5(C,C-1′),110.4(C,C-6),108.7(CH,C-5′),106.2(C,C-10),104.5(CH,C-3′),91.1(CH,C-8),70.8(C,C-3″′),57.2(CH₃,OCH₃),43.6(CH₂,C-2″′),34.5(CH,C-3″),31.2,29.9(CH₃,C-4″′,5″′),23.7(CH₃,CH₃-4″,5″),21.8(CH₂,C-1″′)。ESI-MS:m/z453.2[M-H]^-,477.3[M+Na]⁺（C₂₆H₃₀O₇）。高分辨率ESI-MS：m/z455.2067[M+H]⁺(计算值为C₂₆H₃₁O₇455.2064)。结构解析表明该化合物为Artoheterophyllinxa0J。Artoheterophyllinxa0I的核磁共振光谱数据如下：¹Hxa0NMR(CD₃OD,400MHz)δ:7.08(1H,d,J=8.0Hz,H-6′),6.76(1H,d,J=16.4Hz,H-1″),6.68(1H,d,J=16.4Hz,H-2″),6.56(1H,s,H-8),6.41(1H,overlapped,H-3′),6.40(1H,overlapped,H-5′),5.10(1H,t,J=6.0Hz,H-2″′),3.93(3H,s,OCH₃),3.90(3H,s,OCH₃),3.11(2H,d,J=7.2Hz,H-1″′),1.59,1.40(each3H,s,H-4″′,5″′),1.37(6H,s,H-4″,5″);¹³Cxa0NMR(CD₃OD,100MHz)δ：184.1(C=O，C-4)，164.7(C,C-7),163.9(C,C-2),162.2(C,C-2′),160.5(C,C-5),158.7(C,C-9),158.0(C,C-4′),139.3(CH,C-2″),133.0(C,C-3″′),132.5(CH,C-6′),122.9(CH,C-2″″),122.5(C,C-3),119.89(C,C-1′),113.4(CH,C-1″),109.6(C,C-6),108.2(CH,C-5′),106.1(C,C-10),103.9(CH,C-3′),91.0(CH,C-8),77.6(C,C-3″),56.9(OCH₃,OCH₃-7,4′),27.9(CH₃,CH₃-4″,5″),26.5(CH₃,CH₃-4″′),25.1(CH₂,CH₂-1″″),17.8(CH₃,CH₃-5″″)。ESI-MS:m/z465.3[M-H]^-,489.3[M+Na]⁺（C₂₆H₂₆O₈）。高分辨率HR-ESI-MS:m/z467.1703[M+H]⁺(计算值为C₂₆H₂₇O₈467.1700)。结构解析表明该化合物为Artoheterophyllinxa0I。实施例2癌细胞的培养和处理方法SMMC-7721肝癌细胞系：用Dulbecco′sxa0Modifiedxa0Eagle′sxa0Medium(DMEM)高糖型培养基加10%的胎牛血清及0.1%的双抗溶液培养细胞。将装有细胞的10cm盘置于含5%CO₂、37℃的细胞培养箱中培养。MCF-7乳腺癌细胞系：用Dulbecco′sxa0Modifiedxa0Eagle′sxa0Medium(DMEM)高糖型培养基加10%的胎牛血清及0.1%的双抗溶液培养细胞。将装有细胞的10cm盘置于含5%CO₂、37℃的细胞培养箱中培养。NCI-H460肺癌细胞系：用Roswellxa0Parkxa0Memorialxa0Institute-1640（RPMI-1640）培养基加10%的胎牛血清及0.1%的双抗溶液培养细胞。将装有细胞的10cm盘置于含5%CO₂、37℃的细胞培养箱中培养。实施例3MTT法评价癌细胞抑制活性将Artoheterophyllinxa0J和artoheterophyllinxa0I分别配成10μM、25μM、50μM，进行初筛。对于初筛结果小于25μM的，进行进一步IC₅₀测定。当细胞密度达到70%～80%且细胞状态良好时，铺96孔板，进行细胞计数使每孔有5000个细胞。至细胞完全贴壁即可按药物浓度梯度加药，每孔200μL，设3个复孔，在5%CO₂、37℃加药孵育48h。在加药孵育结束前4h每孔加入20μL5mg/mLMTT溶液继续培养。4h后终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入100μL二甲基亚砜，置37℃培养箱中5min，用酶标免疫检测仪OD560nm处测量每孔的吸光值。设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、培养基、MTT、二甲基亚砜）。计算方法：抑制率=1-OD(调零后加药孔平均值)/OD(对照孔平均值)实施例4两个化合物癌细胞抑制活性评价Artoheterophyllinxa0J和artoheterophyllinxa0I抑制癌细胞的IC₅₀分别如表1所示。上述结果说明：两种化合物具有较强的癌细胞抑制活性；两种化合物可以单独或混合作为乳腺癌、肺癌和肝癌的抑癌制剂。表1.化合物对NCI-H460和MCF-7肿瘤细胞的IC₅₀值ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>注：1：artoheterophyllinxa0J；2：artoheterophyllinxa0I；5-FU：5-氟嘧啶。虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。